发酵过程的代谢控制
第十章 发酵工艺控制的核心原理与实践
江西农业大学生物科学与工程学院
一、发酵过程控制概述
发酵过程控制是发酵工程的重要组成部分，其难点主要在于过程的不确定性和参数的非线性。
关键影响因素
- 同样的菌种和培养基在不同工厂、不同批次会得到不同结果
- 设备差异、水质差异、培养基灭菌差异
- 菌种保藏时间的长短
- 发酵过程中的细微差别
了解和掌握分析发酵过程的一般方法对于控制代谢是十分必要的。发酵控制的核心在于理解微生物代谢的复杂性及其对外界环境变化的响应。
二、发酵过程的种类
在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在特定条件下只完成一个生长周期的培养方法。
在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足导致的发酵过早结束的缺点。发酵结束时发酵液体积比开始时有所增加。
定期从发酵罐中取出部分发酵液，同时补充新鲜培养基，以延长发酵周期。
发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。达到稳态后，菌浓度、产物浓度和限制性基质浓度保持恒定。
三、分批培养
分批发酵定义
分批培养又称分批发酵，是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法。
为什么分批培养是非稳态过程？
微生物分批培养过程中，营养物质不断消耗，代谢产物持续积累，环境条件随时间变化，微生物生长状态也随之改变，因此属于非稳态过程。
四、微生物生长曲线
1. 停滞期（迟滞期）
- 菌体没有分裂只有生长
- 细胞需要适应新环境，核酸和酶被稀释
- 微生物细胞适应新环境的过程
影响停滞期长短的因素
- 接种菌种的生理状态
- 接种量大小
- 培养基成分差异
- 环境条件变化幅度
2. 对数生长期
- 细胞内的分裂相关物质浓度达到临界值
- 细胞开始快速分裂，比生长速率几乎恒定
- 单位时间内细胞数目或重量的增加维持恒定并达到最大值
其中：x—细胞浓度(g/L)；t—培养时间(h)；μ—细胞的比生长速率(1/h)
用细胞浓度的自然对数对时间作图可得直线，其斜率等于μ
倍增时间(td)
微生物细胞浓度增加一倍所需的时间
| 微生物 | 碳源 | 比生长速率(1/h) | 倍增时间(min) |
|---|---|---|---|
| 大肠杆菌 | 复合物 | 1.2 | 35 |
| 大肠杆菌 | 葡萄糖+无机盐 | 2.82 | 15 |
| 中型假丝酵母 | 葡萄糖+维生素+无机盐 | 0.35 | 120 |
| 地衣芽孢杆菌 | 葡萄糖+无机盐 | 0.69 | 60 |
3. 稳定期
- 所有微生物停止生长或细胞增加速度与死亡速率相等
- 出现二次或隐性生长
- 初级代谢产物在对数生长期初期开始合成积累
- 次级代谢产物在对数生长期后期和稳定期大量合成
微生物出现稳定期的原因
营养物消耗、有害代谢产物积累、pH等环境条件改变导致生长速率下降。由于细胞溶解作用，细胞内物质被释放作为营养源，导致存活细胞继续缓慢生长（二次生长）。
4. 死亡期
- 微生物细胞内储存能量基本耗尽
- 细胞在自身所含酶的作用下死亡
- 细胞死亡速率大于增加速度
- 某些次级代谢产物（如抗生素）产生或释放的重要时期
- 操作简单
- 周期短
- 染菌机会少
- 生产过程和产品质量容易掌握
- 产率低
- 不适于测定动力学数据
- 非稳态过程控制难度大
五、补料分批培养
补料分批培养原理
在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。
补料策略关键问题
- 不同补料方式对细胞生长的影响
- 对大肠杆菌来说，何种补料方式对细胞生长最快？
- 何种补料方式对产物的形成最有利？
- 细胞生长速度最快是否也最有利于产物形成？
- 维持低基质浓度，避免碳源阻遏效应
- 通过补料控制达到最佳生长和产物合成条件
- 可利用计算机控制合理补料速率
- 稳定最佳生产工艺
- 产物积累导致比生产速率下降
- 物料加入增加染菌机会
- 操作比简单分批培养复杂
- 需要精确的在线监测和控制
六、连续培养
发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。达到稳态后，整个过程中菌的浓度、产物浓度、限制性基质浓度保持恒定。
- 控制稀释速率可使发酵过程最优化
- 发酵周期长，得到高的产量
- 通过改变稀释速率容易研究菌生长动力学
- 生产效率高，设备利用率高
- 菌种不稳定时，长期培养会引起退化
- 长时间补料染菌机会大大增加
- 需要复杂的控制设备
- 产物浓度通常低于分批培养
七、发酵工艺控制最优化
在特定的发酵生产过程中，生产效率的高低取决于工艺和工艺控制的最优化，即能否实现生产过程内的最优化控制。生产过程最优化控制的实现，包含了从明确目标到目标值实施等全部内容。
最优化控制步骤
- 明确控制目标：提高产量、降低成本、提高质量等
- 明确影响因素：菌种特性、培养基组成、环境参数等
- 确定实现目标值的方法：优化工艺参数、改进控制策略
- 确定最佳工艺：建立稳定可靠的优化工艺
优化关键问题
- 发酵生产过程的主要目的是什么？
- 最优化控制的目标是什么？
- 影响目标值比产物生成速率的因素有哪些？
- 如何确定实现目标值的方法？
- 最佳营养物质的各项参数是按什么浓度参数确定的？
八、研究方法
单因子实验法
对实验中要考察的因子逐个进行试验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实验。
- 一次可以进行多种条件的实验
- 在较短时间内得到结果
- 操作简单，成本较低
- 考察条件多时实验时间长
- 各因子间可能产生交互作用
- 影响结果准确性
- 难以揭示多因素共同作用的复杂关系
九、发酵过程的中间分析
发酵过程中中间分析是生产控制的眼睛，它显示了发酵过程中微生物的主要代谢变化。因为微生物个体极微小，肉眼无法看见，要了解它的代谢状况，只能从分析一些参数来判断。
关键状态参数
- pH值：反映微生物代谢活动和培养基组成变化
- 溶氧(DO)：好氧发酵的关键限制因素
- 尾气氧和二氧化碳：反映微生物呼吸代谢状态
- 粘度：反映菌体生长和产物形成情况
- 菌体浓度：直接反映微生物生长状况
- 基质浓度：糖、氮、磷等营养物消耗情况
- 产物浓度：目标产物积累情况
这些代谢参数又称为状态参数，因为它们反映发酵过程中菌的生理代谢状况。通过实时监测和分析这些参数，可以实现对发酵过程的精确控制。