发酵染菌及其防治 - 第九章内容

一、发酵染菌概述

1. 发酵染菌定义

在发酵过程中，生产菌以外的其他微生物侵入了发酵液，从而使发酵过程失去了真正意义上的纯种培养。

2. 染菌可能途径

菌种培养过程操作不当
培养基灭菌不彻底
发酵设备（如发酵罐、管道）密封不严
空气除菌不净

3. 染菌不良影响

轻度影响

影响产率
降低产物提取收得率
影响产品质量

重度影响

造成生产失败
浪费大量原材料
造成严重经济损失
扰乱生产秩序，破坏生产计划

染菌仍是发酵工业的致命伤

遇到连续染菌，特别是又找不到染菌原因，未有防治措施时，往往会影响人们的情绪和生产积极性，造成无法估量的危害。

4. 染菌不可避免性

发酵类型	平均染菌率
国外抗生素发酵	2%-5%
国内青霉素发酵	约2%
链霉素、红霉素和四环素发酵	约5%
谷氨酸发酵噬菌体感染	1-2%

5. 应对染菌的态度

提高生产技术水平，强化生产过程的管理

把握好各个易染菌的环节，尽可能防止发酵染菌的发生

一旦发生染菌，要能尽快找出其污染的原因

采取相应的有效措施，把发酵染菌造成的损失降低到最小

二、染菌影响因素

1. 不同杂菌种类对发酵的影响

发酵过程	危害最大的杂菌种类
青霉素的发酵	细短产气杆菌
链霉素的发酵	细短杆菌、假单孢杆菌
四环素的发酵	双球菌、芽孢杆菌、荚膜杆菌
谷氨酸的发酵	噬菌体
柠檬酸的发酵	青霉菌

2. 不同生产阶段染菌的影响

种子培养期染菌

对整个发酵过程的危害极大

发酵前期染菌

严重干扰生产菌的生长繁殖

发酵中期染菌

干扰生产菌的代谢，影响产物的生成

发酵后期染菌

影响相对较小

3. 不同染菌原因的影响

种子带菌

将导致染菌范围不断扩大，使生产蒙受重大损失

空气带菌

使发酵大面积染菌

培养基灭菌不彻底

一般不具延续性，使单个(批)发酵罐发酵失败

设备渗漏

染菌几率较大

三、染菌检查与判断

1. 检查判断目的意义

发酵过程是否染菌应以无菌试验的结果为依据进行判断。在发酵生产过程中，如何及早发现杂菌的污染并及时采取措施加以处理，是避免染菌造成严重经济损失的重要手段。

2. 常用检查方法

显微镜检查法

直接观察发酵液中微生物形态

肉汤培养法

通过培养观察微生物生长情况

平板划线培养法

分离和鉴定微生物种类

异常现象观察法

通过发酵过程异常现象判断

3. 发酵过程异常现象判断

溶解氧的异常变化

杂菌是好气性微生物：溶解氧在短时间内下降至零
杂菌是非好气性微生物：溶解氧升高

排气的CO₂异常变化

杂菌污染：糖耗加快，CO₂含量增加
噬菌体污染：糖耗减慢，CO₂含量减少

其他异常现象

菌体生长不良
pH值的异常变化
发酵过程中泡沫的异常增多
发酵液的颜色异常变化
代谢产物含量的异常下跌

                    注意事项
                    无菌试验的肉汤或培养平板应保存并观察至本批(罐)放罐后12h
无菌试验期间应每6h观察一次无菌试验样品

                

四、染菌处理措施

1. 不同阶段的处理措施

种子培养期染菌

应经灭菌后弃之，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌

发酵前期染菌

营养成分消耗不多，应迅速重新灭菌；另外补充必要的营养成分，重新接种进行发酵

发酵中、后期染菌

可以加入适当的杀菌剂或抗生素以及正常的发酵液，以抑制杂菌的生长速度；产品的含量若达一定值，只要明确是染菌也可放罐

2. 发酵后设备的处理

空罐加热灭菌后至120℃以上、30min后，才能使用

用甲醛熏蒸处理

甲醛溶液浸泡12h以上

3. "倒种"概念

当种子受到杂菌污染又无备用种子时，为了保证发酵生产正常进行，从发酵罐内的发酵液中挑取一部分当作种子，接入到新的发酵罐进行发酵生产，叫"倒种"。

五、设备与操作防治

1. 设备渗漏防治

盘管渗漏防止

放罐后要认真清洗发酵罐
控制冷却水质量，降低其中氯离子含量
对盘管定期检查、试漏

隔膜阀使用

严密不漏，无填料
流线型结构，无死角
需定期检查隔膜是否老化及脱落

管路连接

螺纹连接：简单但易松动
法兰连接：密封可靠但费用高
焊接：密封可靠但不宜经常拆卸

2. 空气过滤系统防治

进风口、生产环境保持清洁
空气过滤器滤芯灭菌要彻底
过滤介质要定期检查更换
空气过滤系统带菌会使发酵罐批批染菌

3. 死角问题防治

生产上常把不能彻底灭菌的部位称为"死角"

采取罐内壁涂刷防腐涂料
加强清洗并定期铲除污垢
采用不锈钢或复合钢材料

4. 培养基灭菌不彻底防治

升温前先通过搅拌混合均匀

加入一定量的淀粉酶进行液化

有大颗粒存在时应先经过筛除去

对于麸皮、黄豆饼等固形物含量多的培养基，采用罐外预先配料

5. 操作不当防治

灭菌时排尽罐内空气，避免"假压"
加入消泡剂处理严重泡沫
连续灭菌过程中避免蒸汽压力波动过大
探头或元件保证灭菌彻底

六、噬菌体污染防治

噬菌体污染处理方法

选育抗性菌株

轮换使用专一性不同的菌株

加化学药物(如谷氨酸发酵可加2~4ppm氯霉素)

将培养液重新灭菌再接种(噬菌体不耐热，70~80℃经5分钟即可杀死)

谷氨酸发酵特殊处理方法

在初期感染噬菌体，可以利用噬菌体只能在生长阶段的细胞中繁殖的特点，将发酵正常并已培养了16~18小时(此时菌体已生长好并肯定不染菌)的发酵液加入感染噬菌体的发酵液中，以等体积混合后再分开发酵。

噬菌体污染防治措施

环境管理

认真保藏好生产菌株
严禁活菌体排放
加强环境卫生工作

监测措施

强化设备管理
加强对无菌空气监测
加强对空间杂菌及噬菌体监测

七、染菌原因分析

1. 国外抗生素发酵染菌原因分析

染菌原因	百分率(%)	染菌原因	百分率(%)
种子带菌	9.64	蛇管穿孔	5.89
接种时罐压跌零	0.19	接种管穿孔	0.39
培养基灭菌不透	0.79	阀门泄漏	1.45
空气系统带菌	19.96	罐盖漏	1.54
搅拌轴密封泄漏	2.09	其他设备漏	10.13
泡沫量压	0.48	操作问题	10.15
灭菌	12.36	原因不明	24.91

2. 从染菌规模分析原因

大批发酵罐染菌：空气系统问题
部分发酵罐(或罐组)染菌：前期可能是种子带杂菌，中后期可能是中间补料系统或油管路系统问题
个别发酵罐连续染菌：设备问题(如阀门渗漏或罐体腐蚀磨损)
个别发酵罐偶然染菌：原因复杂，各种染菌途径都可能引起

3. 从染菌时间分析原因

发酵早期染菌

种子带菌
培养基灭菌不彻底
设备或管道有死角

中、后期染菌

中间补料问题
设备渗漏
操作不合理

4. 从染菌类型分析原因

杂菌种类	染菌原因分析
耐热的芽孢杆菌	死角或灭菌不彻底
球菌、无芽孢杆菌等不耐热菌	种子带菌/空气除菌不彻底
浅绿色菌落的杂菌	设备或冷却盘管的渗漏
霉菌	灭菌不彻底或无菌操作不当
酵母菌	糖液灭菌不彻底或糖液放置时间过长